四特异性分子唤醒NK细胞抗肿瘤活性
近年来，NK 细胞在癌症免疫治疗中受到越来越多的关注，因为 NK 细胞在诱导有效的抗肿瘤反应的同时，其毒性风险也比较低。为了实现 NK 细胞的有效激活，就需要不同激活受体的协同作用。比如 IL-2 信号可以增加NK细胞的激活和增殖，而其他激活受体可以增强 NK 细胞的杀伤能力。
为了诱导肿瘤特异性NK细胞激活，Demaria、Gauthier、Vetizou 等人建立了一套基于四特异性抗体的 NK 细胞治疗 (ANKET)，利用肿瘤相关抗原 (TAA) 来引导和激活 NK 细胞，并在临床前研究中系统评估了其有效性和安全性。该成果最近以题为“Antitumor immunity induced by antibody-based natural killer cell engager therapeutics armed with not-alpha IL-2 variant”的研究论文发表在《Cell Reports Medicine》上。考虑到NK细胞在血液和肿瘤微环境中表达 NKp46、CD16a 和 CD122-CD132 二聚体 IL-2 受体，研究团队将这些受体作为靶点设计了四特异性 ANKET 分子。
ANKET™ (Antibody-based NK cell Engager Therapeutics) 是 Innate Pharma 公司的专利技术平台，可用于开发下一代多特异性 NK 细胞接合剂，以治疗某些类型的癌症。ANKET™ 是一类新的多功能、多用途的复合分子，可以诱导对癌症的合成免疫，既可充分利用 NK 细胞对抗癌细胞的优势，又可提供针对 NK 细胞的增殖信号和激活信号。
▲ ANKET 的作用方式（来自 innate pharma）
四特异性分子 ANKET 包括以下几个部分：(1) 靶向激活 NKp46 的抗体片段;(2) 结合并激活 CD16a 的 IgG Fc 结构域;(3) 突变型 IL-2v 结合 CD122 和 CD132，但不结合 CD25 (防止激活 Tregs 细胞，优先促进 NK 细胞的 IL-2R 信号通路);(4) 靶向肿瘤相关抗原 CD20 的抗体片段。
研究团队首先在体外实验中验证了四特异性 ANKET 可以有效激活 NK 细胞，并导致其产生 IFNγ 和 MIP-1β，以及杀伤 CD20+ Raji B 细胞淋巴瘤靶细胞。IFNγ 和 MIP-1β 等细胞因子的产生水平，依赖于 CD16a 和 NKp46 的结合，而没有这些结合物的 ANKET 对照组则只能导致很低水平的细胞因子产生。当 IL-2v 缺失时，细胞因子的产生也会减少，这提示 ITAM (NKp46和CD16a) 和 JAK/STAT (IL-2) 信号通路的协同作用在受刺激 NK 细胞的功能活性中所起的作用。
对 CD20+ Raji 细胞系的杀伤实验表明，四特异性 ANKET 增加了 NK 细胞的肿瘤杀伤能力，且不会引起脱靶效应。与肿瘤抗原和激活受体的协同作用是细胞毒性作用的必要条件。剂量效应研究表明，部分 ANKET 与 NK 和靶细胞结合就足以诱导杀伤活性，表明即使在 TAA 受体占用率较低的情况下，ANKET 也能产生很强的杀伤肿瘤作用。
接着，研究人员从健康对照血液中纯化的了 NK 细胞，并在体外用四特异性 ANKET 进行激活。随后作者对这些 NK 细胞进行了 RNA-seq ，并分析了与 ANKET 诱导的特异性基因表达程序改变。作者发现，ANKET 处理后上调的基因包括参与 NK 细胞激活和功能、细胞介导杀伤和参与调节免疫突触形成的结构成分的基因。此外，NK 细胞效应功能、膜运输、细胞周期、氧化磷酸化和 mTORC1 等通路的活性也出现上调。基因集富集分析显示，IFN-γ 和细胞因子反应相关基因得到了富集。这些基因表达模式是与四特异性 ANKET 相关的，而且与缺少一个或多个片段的对照分子不同。此外，参与 NK 细胞和树突状细胞之间的交流的基因也增加，表明 ANKET 治疗也可能促进适应性免疫反应。
流式细胞术分析显示，NK 细胞与四特异性 ANKET 作用后，其激活标记 CD69 上调，从蛋白质层面证实了转录组数据。为了评估治疗是否激活特定的 NK 细胞亚群，作者为文献报道中描述的每个 NK 细胞亚群创建 NK 细胞基因集。ANKET 刺激将 NK 细胞群的分布从 NK1 亚型 (CD56dim CD16a+CD57+) 转变为细胞因子诱导的记忆样(CIML) 表型丰富的 NK 细胞群体。这些 CIML 细胞是一个长寿命的 NK 细胞亚群，指示更好的 NK 细胞效应功能。
然后，研究人员转向体内模型研究四特异性 ANKET 的抗肿瘤反应。免疫缺陷小鼠皮下移植 CD20+ Raji B 细胞淋巴瘤，这些小鼠有 NK 细胞，但缺乏 T 和 B 细胞。单次注射 ANKET 可导致肿瘤消退和长达 30天的肿瘤控制。相比之下，在这个侵袭性动物模型中，抗 CD20 抗体 Obinutuzumab 对肿瘤生长的影响十分有限。使用不同剂量的 ANKET 表明，尽管 ANKET 治疗小鼠存在剂量依赖性的体重减轻，但 ANKET 存在一个安全的治疗窗口。
ANKET 的抗肿瘤作用需要 NK 细胞参与，因为如果 ANKET 中没有 CD20 结合部分，就无法观察到肿瘤的控制。此外，缺乏 NKp46 和 CD16a 结合物的分子比四特异性版本的效果更差。在四特异性 ANKET 处理的小鼠中，NK 细胞数量增加，表达早期激活标记 CD69 和增殖标记 Ki67 的 NK 细胞比例增加。
为了评估治疗是否也增加了 NK 细胞肿瘤浸润，研究人员在共表达人类 NKp46 的小鼠中使用 Raji B 淋巴瘤模型，以识别与小鼠 NKp46 结合的 ANKET 存在时浸润的 NK 细胞。治疗后的小鼠肿瘤微环境中 NK 细胞大量浸润。治疗也诱导了更高水平的 Ncr1 转录本 (编码 NKp46) 和 IFN-γ 和 Gzmb 转录本的水平，表明 NK 细胞浸润增加与效应活性。NK 细胞的清除，则会消除 ANKET 对肿瘤的控制作用，证实了 ANKET 治疗效果需要 NK 细胞的参与。在具有免疫能力的小鼠中，治疗诱导了脾脏中 NK 细胞的扩增和激活。此外，ANKET 还增加了 CD8+ T 细胞水平，导致 CD8/CD4 比值增加。在表达 CD20 的 B16F10 黑色素瘤免疫小鼠模型中，ANKET 治疗也成功地控制了肿瘤的生长。
最后，研究人员在非人类灵长类动物身上评估了 ANKET 是否可以安全有效地对肿瘤进行治疗。单次剂量的 ANKET 没有引起任何临床毒性迹象，但表现出以剂量依赖性的方式清除了循环 B 细胞，表明 ANKET 的安全性和有效性。血浆中各种细胞因子的水平也有轻微、快速且短暂的增加，并在 24小时内恢复到基线水平。
总之，本研究通过临床前研究展示了一种多特异性的靶向 NK 细胞的接合剂 ANKET，并证明了其效力和安全性。ANKET 可以刺激 NK 细胞特异性靶向肿瘤细胞，而不诱导 Treg 反应。这种治疗策略的毒副作用可能小于其他免疫治疗策略。因此，确定这种或其他 NK 细胞参与疗法是否能在患者中实现类似的结果，将是未来非常值得进行探究的课题。
▲ 图：全文总结（来自 ACIR）
参考文献：Antitumor immunity induced by antibody-based natural killer cell engager therapeutics armed with not-alpha IL-2 variant. Cell Rep Med. 2022 Oct 18.
来源：BioMedAdv 2022-11-25
